Nat Aging︱王国昊/陆伟/侯宪玉等发现神经元聚集过氧化脂质激活小胶质细胞NLRP3炎症体促进脱髓鞘和神经元退化
撰文︱王国昊
责编︱王思珍
脂质过氧化（lipid peroxidation）是指活性氧将多不饱和脂肪酸氧化成过氧化脂质产物，如丙二醛 （MDA），它可以交联或改变蛋白质、脂质、碳水化合物和脱氧核糖核酸（DNA）的结构，从而影响细胞膜的流动性和渗透性以及其他生物学特性, 导致非特异性的全身损伤[1-5]。过度活跃的神经元也会产生过氧化脂质（peroxidated lipids）。研究表明，神经元（neuron）可以通过神经元和星形胶质细胞（astrocyte）之间的脂质传递来避免过氧化脂质的神经毒性[6]。具体来说，积累的脂肪酸和过氧化脂质经过 载脂蛋白E(APOE) 阳性的脂质颗粒转移到星形胶质细胞，然后通过星形胶质细胞的线粒体（mitochondria）氧化代谢消耗过氧化脂质，从而维持神经元和星形胶质细胞处于低氧化脂质状态，进行正常生理活动。在严重损伤情况下，例如由线粒体功能障碍引起的损伤，过氧化脂质的水平超过细胞防御机制，它们可以促进有害的过氧化、过氧化链反应并导致神经变性[7]，然而具体机制尚不清楚。据推测，过氧化脂质可能引发全身性的非特异性损伤。ADP-核糖基化因子 1（ARF1） 是一种 Ras 超家族 GTPase，参与多种重要的生物学过程，包括脂质代谢、维持线粒体功能、内吞作用、质膜信号传导和细胞微管上的细胞器运动等[8-18]。成年神经元中聚集过氧化脂质如何导致的神经退化尚未研究清楚，小胶质细胞在过氧化脂质诱发的神经退化过程中的作用是什么？也未深入研究。
2021年11月11日，复旦大学生命科学学院的侯宪玉（Steven X. Hou）教授和美国国立卫生研究院国家神经病学和中风研究所的陆伟（Wei Lu）研究员在Nature Aging上发表了题为“Neuronal accumulation of peroxidated lipids promotes demyelination and neurodegeneration through the activation of the microglial NLRP3 inflammasome”的文章。博士后王国昊（Guohao Wang）为该文章的第一作者和并列通讯作者。本研究阐明了小胶质细如何参与神经元内过氧化脂质聚集导致的神经脱髓鞘和神经退行性病变，证明了成年小鼠神经元内敲除ARF1引起过氧化脂质累积，并释放ATP和过氧化脂质激活小胶质细胞的NLRP3（含NOD、LRR 和pyrin 结构域的蛋白3）炎症体，进而引发脱髓鞘的神经退行性病变。
在小鼠的髓鞘内先天敲除ARF1会影响施旺细胞（Schwann cells）形成神经元的髓鞘[19]。但是在成年小鼠中ARF1的重要生理作用仍未研究。作者最初构建ARF1条件敲除小鼠为了研究该蛋白在维持肿瘤干细胞的功能。通过全身条件敲除偶然发现该老鼠出现神经退行性疾病的表型，并且该表型在不同年龄的成年小鼠内一致，敲除ARF1以后小鼠会在40天内死亡。ARF1敲除以后，随着时间的推移，小鼠出现体重降低、游泳时间缩短、与对照相比走相同距离需要更长的时间、后肢运动缓慢、步伐紊乱、肌肉萎缩、走路时颤抖、休息时颤抖、无精打采、嗜睡、共济失调、外套邋遢和不能运动等现象。最终因无法自主进食与喝水而安乐死。以上证据表明成年小鼠中敲除ARF1导致的神经退化表型与年龄无关（图1）。
图1 成年小鼠敲除ARF1有运动缺陷
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
在注射他莫昔芬敲除ARF1 3-4 周后，作者观察到小鼠脊髓和后脑的髓突触数量显著减少，脱髓鞘（轴突直径/轴突加髓鞘直径）现象增加及神经元数量减少等现象。这说明敲除ARF1导致小鼠瘫痪的主要原因是神经元退化（图2）。
图2 成年小鼠敲除ARF1出现神经元退化、脱髓鞘及突触数量减少。
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
由于上述表型是利用全身ARF1条件敲除小鼠获得的行为学表型与病理现象。成年小鼠中敲除ARF1导致的表型是何种细胞起主要作用呢？为此，作者选择了大脑不同细胞特异诱导表达的Cre进行不同种类的细胞中敲除ARF1, 这些细胞包括：星形胶质细胞（GFAP-CreER）、少突胶质细胞前体（Pdgfra-CreER）、少突胶质细胞与施旺细胞（Plp1-CreER、Sox10-CreER）、 髓细胞（LysM-CreER）、 小胶质细胞（Cx3cr1-CreER和 Tmem119-CreER），和神经元（Thy1-CreER）。这些不同种类细胞内敲除ARF1，只有神经元内敲除ARF1可以重现全身敲除ARF1导致是神经退化表型。这些结果提示，神经元特异性敲除ARF1会导致脱髓鞘，突触减少和小胶质细胞激活等现象（图3）。
图3 神经元内敲除ARF1诱导神经退化。
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
那么神经元内敲除ARF1如何以及为什么诱发神经退化？作者深入研究发现，敲除ARF1以后会导致过氧化脂质累积，致使神经元向外释放过氧化脂质和ATP，转移到周围的小胶质细胞内；并通过神经元与小胶质细胞共培养发现过氧化脂质可以依赖APOE传递到旁边的小胶质细胞（图4）。过氧化脂质和ATP激活小胶质细胞中的NLRP3炎症体，激活的炎症体释放IL-18和IL-1b进而诱导脱髓鞘（图5）。
图 4 神经元内敲除ARF1释放过氧化脂质。
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
图 5过氧化脂质通过激活小胶质细胞的NLRP3炎症体促进神经退化。
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
由于NLRP3炎症体激活可以促进脱髓鞘和神经元退化，因此作者利用NLRP3抑制剂MCC950处理ARF1敲除小鼠及全身敲除NLRP3蛋白的小鼠与神经元内敲除ARF1蛋白的小鼠杂交获得双突变纯合子来观察神经退行性表型。作者发现，利用MCC950或者全身敲除NLRP3都可以抑制ARF1敲除导致的神经元退化、脱髓鞘和炎症因子释放的表型。以上结果说明NLRP3炎症小体对小鼠的神经退化起重要的作用（图6）。
图 6 NLRP3炎症体抑制剂和敲除NLRP3可以抑制成年小鼠的神经退化、炎症因子释放和脱髓鞘。
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
接下来，作者利用RNA测序观察了ARF1敲除以后小鼠脊髓的全基因变化。与对照组比较发现，ARF1敲除以后有70个基因表达增加和110个基因表达降低。利用KEEG和Metascape注释和分析所影响的关键生物学过程，富集分析显示补体级联和炎症反应是高表达基因中的两个主要蛋白簇，而髓鞘相关基因是下调基因的主要簇。这一结果与前面实验发现的结果一致，说明神经元内敲除ARF1导致炎症反应与脱髓鞘等神经退化现象（图7）。
图 7 神经元内敲除ARF1导致炎症反应基因表达上调与髓鞘相关基因表达下调
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
由于发现小鼠中敲除ARF1导致脊髓和后脑的神经炎症反应，作者推测是否在多发性硬化（multiple sclerosis，MS）和肌萎缩脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）患者中也会有类似的病理现象？因此，接下来作者从美国国立卫生研究院脑库找到捐献者的小脑、脑干和脊髓样品，进行切片免疫组化染色和Western Blot，发现与正常人相比，MS和ALS患者的脑和脊髓中也出现脱髓鞘和ARF1蛋白降低的病理现象，并且也存在NLRP3炎症体激活的现象。这说明ARF1诱导的NLRP3也存在于ALS和MS病人中（图8）。这与其他研究组报道阿尔兹海默症（Alzheimer's disease）病人中存在NLRP3炎症体激活的现象类似[20, 21]。
图8 MS和ALS患者存在ARF1蛋白减少相关的神经炎症通路
（图源：Wang G, et al., Nat Aging, 2021）
本文证明了NLRP3炎症体激活存在于ARF1敲除的小鼠中，也存在与ALS和MS患者。由此，我们可以推断炎症体激活与ALS和MS存在一定的关联，思考通过抑制炎症体激活来治疗和减缓ALS和MS两种疾病。由于炎症体激活只在ARF1敲除小鼠的后脑和脊髓中出现明显现象，为何前脑区域没有出现明显的小胶质细胞激活？这一问题有待深入研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s43587-021-00130-7
王国昊（左），第一作者和和并列通讯作者；陆伟（中）、侯宪玉（右），通讯作者。
（照片提供自陆伟和侯宪玉实验室）
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参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完